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    探討免疫細胞轉(zhuǎn)染時要注意的一些基本事項

    發(fā)布時間: 2022-09-12  點擊次數(shù): 1295次
       理想的免疫細胞轉(zhuǎn)染法,應(yīng)該具有轉(zhuǎn)染效率高、細胞毒性小、重復(fù)性好、安全、簡單等優(yōu)點。病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù),是目前轉(zhuǎn)染效率高的方法,同時具有細胞毒性很低的優(yōu)勢。但病毒轉(zhuǎn)染方法的準備程序復(fù)雜,常常對細胞類型有很強的選擇性,在一般實驗室中很難普及。其它物理和化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法則各有其特點。
      免疫細胞轉(zhuǎn)染時我們應(yīng)注意的一些要點如下:
      1.如為貼壁生長細胞,一般要求在轉(zhuǎn)染前一日,必須應(yīng)用胰酶處理成單細胞懸液,重新接種于培養(yǎng)皿或瓶,轉(zhuǎn)染當日的細胞密度以70-90%(貼壁細胞)或2×106-4×106細胞/ml(懸浮細胞)為宜,在轉(zhuǎn)染前4h換一次新鮮培養(yǎng)液。
      2.用于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA必須無蛋白質(zhì),無RNA和其他化學(xué)物質(zhì)的污染,OD260/280比值應(yīng)在1.8以上。
      3.培養(yǎng)基中的抗生素
      抗生素是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些抗生素一般對于真核細胞無毒,但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細胞的通透性,使抗生素可以進入細胞。這降低了細胞的活性,導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低。所以,在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用抗生素。
      對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素,因為這些抗生素是選擇性抗生素的競爭性抑制劑。另外,為了保證無血清培養(yǎng)基中細胞的健康生長,使用比含血清培養(yǎng)基更少的抗生素量。
      4.設(shè)置陽性對照和陰性對照。
      5.一般在轉(zhuǎn)染24-48h,靶基因即在細胞內(nèi)表達。根據(jù)不同的實驗?zāi)康模?4-48h后即可進行靶基因表達的檢測實驗。
      6.如若建立穩(wěn)定的細胞系,則可對靶細胞進行篩選,根據(jù)不同基因載體中所含有的抗性標志選用相應(yīng)的藥物,常用的真核表達基因載體的標志物有潮霉素和新霉素等。
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