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    質(zhì)粒構(gòu)建的心得分享

    發(fā)布時(shí)間: 2024-02-20  點(diǎn)擊次數(shù): 489次

    質(zhì)粒是我們?nèi)粘?shí)驗(yàn)中比較常用的載體,其可以自主生長(zhǎng),也能通過(guò)比較容易的方法進(jìn)行大量擴(kuò)增,但往往單一的質(zhì)粒不能滿足實(shí)驗(yàn)需求,需通過(guò)一系列方法進(jìn)行質(zhì)粒重組,我目前比較常用的方法也就是比較陳舊的酶切重組質(zhì)粒的方式,簡(jiǎn)易實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下圖:

    1708396293214.png

    在這個(gè)過(guò)程中,有幾個(gè)小Tips:

    1.原載體的酶切位點(diǎn)由文獻(xiàn)、載體說(shuō)明書或者導(dǎo)師建議得來(lái),選擇正確的酶切位點(diǎn)是重組質(zhì)粒開始的第一步,常見的酶切體系如下:

    image.png

    上述體系適用于大多數(shù)酶切,不是特別難切開的載體1μl內(nèi)切酶足夠,酶切前計(jì)算好量,先加ddH2O,最后加內(nèi)切酶。


    2.酶切完成后,需要跑瓊脂糖膠鑒定酶切效果,配膠時(shí)注意選擇合適的膠濃度,原則是分子量越大,膠濃度越小。跑膠完成后紫外燈下一般會(huì)有兩段即為成功:載體和切下來(lái)的片段,根據(jù)結(jié)果進(jìn)行膠回收,注意切下來(lái)的片段不回收,膠回收完成后測(cè)濃度備用。


    3.插入片段根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)選擇,通常插入片段可以通過(guò)PCR而來(lái),或者是一段由三方公司合成的序列,在連接開始前也需要用同樣的兩個(gè)內(nèi)切酶切出缺口。常見連接體系如下:


    圖片
    16℃連接4h以上或過(guò)夜。

    其中,加入載體和插入片段的量由說(shuō)明書得來(lái),加樣前計(jì)算好量,先加ddH2O,最后加連接酶,由于連接體系較小,一般使用pcr管進(jìn)行。

    4、為確保連接的順利進(jìn)行,務(wù)必保證連接酶和連接酶緩沖液配套使用,即使用同一廠家的,不能混用。

    5、上述過(guò)程中涉及到的不管是內(nèi)切酶還是連接酶,都是比較昂貴的,使用時(shí)要用冰盒,用完及時(shí)放回-20℃冰箱。
    6、進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí),根據(jù)載體說(shuō)明書選擇合適的感受肽細(xì)胞,同時(shí)仔細(xì)閱讀感受肽細(xì)胞說(shuō)明書,看清涂板體積、涂板后的培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度等。
    7、挑取單克隆時(shí),推薦至少選擇兩個(gè)及以上。
    8、搖菌時(shí),注意擰松菌管的蓋子,傾斜放入恒溫(一般為37℃)搖床,搖菌時(shí)間12-16h為宜。
    9、搖菌完成后進(jìn)行質(zhì)粒提取,測(cè)濃度后送測(cè)序,注意這里會(huì)有部分說(shuō)明書推薦選擇新的內(nèi)切酶酶切后跑瓊脂糖膠進(jìn)行鑒定,這也是一種鑒定方式,可以根據(jù)酶切片段的大小來(lái)判斷重組是否正確,但是,最終確定還是推薦進(jìn)行測(cè)序,因?yàn)槲覀儫o(wú)法保證在整個(gè)過(guò)程中堿基不會(huì)發(fā)生突變,可以根據(jù)上述方式選擇酶切片段大小正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。

    測(cè)序的準(zhǔn)確性對(duì)于后續(xù)慢病毒感染是非常重要的,因此測(cè)序公司的選擇十分重要,尤其出現(xiàn)一些比較難測(cè)的結(jié)構(gòu)如shRNA的發(fā)卡結(jié)構(gòu)等,測(cè)序技術(shù)不成熟的話會(huì)一直報(bào)重疊峰或者測(cè)不通的情況。

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