養(yǎng)過細胞的小伙伴們肯定都知道，細胞養(yǎng)得好不好就看細胞傳代是的操作手法好不好了。因為懸浮細胞是可以不用消化直接離心收集沉淀就好，基本沒有操作難度。所以今天我們主要來聊一聊貼壁生長的細胞的傳代操作方法。

      貼壁生長的細胞當(dāng)在培養(yǎng)瓶內(nèi)長成致密的單層后，由于繼續(xù)生長的空間不足，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成份也消耗較多，同時代謝廢物也會增多時，即細胞密度長到80%-90%時，則說明需要對細胞進行傳代操作來分瓶培養(yǎng)或者凍存處理。

      實驗室時內(nèi)最-常用的傳代方法是胰酶消化法。一般細胞系和較常見的原代細胞都可以使用胰酶消化法來進行細胞的消化處理。不過，這種方法對操作者的手法要求較高，畢竟如果消化不足吧，細胞下不來，或者細胞還是聚團狀的；消化過頭了吧，對于細胞的損傷較大，不利于細胞的長期培養(yǎng)。那么，今天我們就來聊聊關(guān)于胰酶消化的那些事吧。

      首先，小伙伴們要做好實驗前的準(zhǔn)備工作哦，要知道消化時間就那么幾分鐘，如果準(zhǔn)備不充足，可能消化時會手忙腳亂嚴重的更是導(dǎo)致細胞消化過度呢。所以，我們來看看有哪些實驗前的準(zhǔn)備工作要做吧。

      為了不刺激細胞，同時使胰酶的消化效率-最高，我們需要將消化時要用到的試劑，比如胰酶，終止液，培養(yǎng)基等，提前放入37℃水浴鍋內(nèi)進行預(yù)熱處理呢。

小伙伴們一定要加強自己的無菌意識。良好的無菌意識是細胞實驗成功的前提，所以我們要提前做好消毒措施。實驗前打開超凈工作臺的紫外燈開關(guān)，紫外消毒至少半小時。工作臺消好毒后，用75%酒精擦拭工作臺表面，點燃酒精燈，（注意酒精燈的火焰不能太小也不能太大，安全也很重要，不要燒到手），然后將預(yù)熱好的試劑（用75%的酒精擦拭試劑的表面，擦干，小心瓶口過火的時候未擦干的酒精燃燒）放入工作臺，同時準(zhǔn)備好需要的一次性滴管，離心管之類的耗材。正確擺放需使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染的概率。

      提前在離心管上寫好細胞的名稱并將胰酶中止液加入到離心管中，保證中止液的量是所加的胰酶的量的2-3倍。否則可能導(dǎo)致中止不完-全，細胞消化過度。

      準(zhǔn)備工作做好了，就要開始進行細胞的消化了。消化的過程要做到忙而不亂，有序進行操作。由于一般的消化時間也就只有2-5分鐘左右，所以操作時不能太慢，比如已經(jīng)看見細胞消化完-全了，結(jié)果操作時加入中止液用了30秒，那這樣的話則完-全無法避免細胞消化過度這種事情的發(fā)生了。當(dāng)然，因為著急怕細胞消化過度而導(dǎo)致忽略了無菌操作也是不可取的。

      消化之前用PBS洗滌一到兩遍，是常見的操作，因為培養(yǎng)基中的血清含有抑制胰酶的蛋白。小心吸出舊培養(yǎng)基，用PBS清洗（沖洗），然后加入適量消化液（胰蛋白酶液），一般來說，細胞系的消化用0.25%的胰酶，而原代細胞的消化則需要用更溫和的0.05%的胰酶。注意消化液的量以蓋住細胞表面最好，一般T25瓶中加入1ml左右，T75瓶中加入3ml左右即可，最佳消化溫度是37℃。將加好胰酶的培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中消化，記錄好消化時間。

      胰酶消化的程度是一個關(guān)鍵：消化過度則對細胞的活性損傷較大，并有部分細胞漂??；消化不足則細胞難于從瓶壁上吹下，反復(fù)吹打同樣也會損傷細胞活性。影響消化速度的因素較多，主要有胰酶溶液的活性（配制條件、凍存或4℃保存時間長短、是否反復(fù)凍融、化凍后存放時間及溫度等）、消化時的溫度（氣溫、細胞培養(yǎng)瓶及胰酶溶液的溫度）以及所加胰酶溶液的多少等。

      而且細胞的消化時間是沒有一個準(zhǔn)確的數(shù)值定論的，同一個細胞同一個人操作，第一次和第二次的消化時間也不盡相同，畢竟人操作的如擰緊瓶蓋，走路從工作臺到培養(yǎng)箱的時間等不可控的因素太多了。所以我們只能記錄一個大概的時間范圍，那么，下次再次消化這種細胞時可提前設(shè)定好時間，提前將消化的細胞拿出培養(yǎng)箱防止消化過度。

      一般書上都說要在顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察消化細胞，若胞質(zhì)回縮，細胞之間不再連接成片，表明此時細胞消化適度。實際上當(dāng)我們真的這樣操作時，可能細胞都有一點點消化過度。不是細胞全部成間隔分布很離散的單個圓形才算消化好了，一般你肉眼觀察貼壁細胞層，只要能移動了，多半呈流沙狀移動時，其實細胞的消化已經(jīng)可以了。很多人喜歡把細胞消化或者吹打成完-全分離細胞，這是沒有必要的。一般細胞呈流沙狀移動了，說明細胞與培養(yǎng)瓶的附著已經(jīng)消失了，細胞之間的附著也已經(jīng)消失了，說明細胞已經(jīng)獨立分布了（雖然沒有呈現(xiàn)很廣的離散分布）。這個時候就應(yīng)該停止消化，不要等到看到鏡下所有細胞都分離得非常好，間隙很大，才停止，這樣會導(dǎo)致細胞消化過度。細胞就是完-全成單個細胞懸液，之后在貼壁的過程中仍然會聚集，這個是貼壁培養(yǎng)的細胞，尤其是腫瘤細胞的一個特性，無論死的活的細胞都是如此。小伙伴們?nèi)绻恍?，可以在平時消化細胞的時候觀察觀察，也可以嘗試一下，準(zhǔn)備100%的單個細胞懸液，貼壁后觀察細胞，仍然是幾個幾個細胞聚集在一起。一些懸浮培養(yǎng)的細胞也是如此，容易聚集生長，所以不要去嘗試過幾個小時就把細胞拿出來吹打幾下，直到細胞分散成單細胞懸液（看到這里，有些小伙伴可能覺得很好笑，但是這個是初養(yǎng)懸浮細胞的小伙伴們經(jīng)常犯的錯誤，以為懸浮培養(yǎng)的細胞就是一個一個分開的）。細胞只要能從基質(zhì)上脫離下來，即使這個時候是成片的（比如Calu-3細胞），吹打不超過20次后（一般10次即可），成小規(guī)模聚集（10個細胞左右），是正常的，不要試圖再去延長消化時間，或者像有的同學(xué)那樣吹打1h，等待單細胞懸液出現(xiàn)，這樣會導(dǎo)致細胞消化過度，細胞裂解甚至死亡。    觀察到細胞脫落，那么就只剩下最后一步，細胞的消化就基本完成了。將消化好的細胞懸液加入到含中止液的離心管中，并用中止液潤培養(yǎng)瓶，中止細胞消化。同時，用滴管輕輕將已經(jīng)消化細胞吹打成細胞懸液。平衡后將離心管放入臺式離心機中，以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，收集細胞沉淀，那么，細胞消化的過程就已經(jīng)完成，小伙伴們可以繼續(xù)接下來的傳代或者凍存的操作了。

      事實上，除了常見的胰酶消化外，也有許多小伙伴不用胰酶，只用EDTA，或者用胰酶/EDTA聯(lián)合作用的方式來進行消化。但是，小伙伴們，你們要明白，胰酶的作用是切斷細胞與培養(yǎng)基質(zhì)之間的一些負責(zé)粘連和附著的蛋白，而EDTA則是通過螯合Ca離子，從而作用于Integrin的活性，來使細胞與培養(yǎng)基質(zhì)分離。所以綜合而言，EDTA的作用更加溫和。當(dāng)然也有一些人在胰酶里添加一些EDTA，或者在對付特別難消化的細胞，添加多一些EDTA，也是同樣的道理。注意EDTA是不能被血清中和的，使用EDTA消化細胞后原先的培養(yǎng)瓶要徹-底清洗，否則再培養(yǎng)時細胞容易貼壁不牢。

      在遇到特別難消化的細胞，小伙伴們不要試圖通過延長消化時間（如果10min還消化不徹-底的話）的方法來使消化完-全，而應(yīng)該想想其它辦法。消化比較難消化的細胞時，注意需要用不含Ca，Mg離子的DPBS來進行潤洗，因為這些離子也會抑制胰酶的活性。同時一般可以先用少量胰酶進行孵育再來進行消化，但也不需要加入很多胰酶，一般來說100 mm皿，一次最多加入500ul胰酶來孵育就已經(jīng)足夠了。通常來說，對于難消化的細胞，使用這樣的消化手法，一般不超過5min，就可以看見細胞成流沙狀移動，這時即應(yīng)該停止消化。

      當(dāng)然，當(dāng)在顯微鏡下看見貼壁的細胞成片或者聚團生長時，不要以為成片分布是自己沒養(yǎng)好，消化的時候沒有消化完-全，這個要視細胞而定。如果和標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)不一致，那有可能是自己沒消化好導(dǎo)致的，但如果消化方法正確，也觀察到細胞消化完-全了，卻仍然成片分布，甚至完-全吹打成單細胞懸液，細胞在貼壁后仍然成片分布，那么可以肯定這是細胞的特性，是因為貼壁過程中重新聚集了。這個時候你拼了命要去讓它均勻分布，你的細胞之后會越來越不好，甚至導(dǎo)致細胞的死亡。

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